科研動(dòng)態(tài)

近日，美國 J.Craig Venter Institute（克雷格·文特爾研究所）Sanjay Vashee 研究員成果以“A synthetic genomics-based African swine fever virus engineering platform（基于合成基因組學(xué)的非洲豬瘟病毒工程平臺(tái)）”為題在 Science Advances（Q1 IF:11.7） 發(fā)表。

非洲豬瘟（ASF）是家豬的一種致命性病毒性疾病，對全球養(yǎng)豬業(yè)有著巨大的經(jīng)濟(jì)影響。它存在于非洲、歐洲、亞洲以及加勒比海的伊斯帕尼奧拉島。目前沒有有效的治療方法，也沒有廣泛獲批許可的疫苗來預(yù)防這種疾病。由于缺乏方便的工具來對其病原體非洲豬瘟病毒（ASFV）進(jìn)行基因改造，抗擊非洲豬瘟的努力受到了阻礙，這在很大程度上是因?yàn)槠潺嫶蟮姆歉腥拘曰蚪M。本研究中作者報(bào)告了利用合成基因組學(xué)方法，借助一種由 CRISPR-Cas9 抑制的自輔助病毒，開發(fā)出一種針對非洲豬瘟病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，以便從合成基因組中重建有活性的重組非洲豬瘟病毒，從而快速產(chǎn)生各種非洲豬瘟病毒的組合突變體。該方法將極大地促進(jìn)針對非洲豬瘟的治療方法、亞單位疫苗和減毒活疫苗的開發(fā)。

作者基于之前的研究提出了一個(gè)假設(shè)：一種其復(fù)制能被某種機(jī)制（如宿主細(xì)胞中的 Cas9 切割）有效抑制的非洲豬瘟病毒株，應(yīng)該可以作為一種自輔助病毒，用于包裝或 “啟動(dòng)” 對該抑制機(jī)制具有抗性的非洲豬瘟病毒株的病毒粒子 DNA，從而實(shí)現(xiàn)病毒的重建。這個(gè)想法類似于 20 世紀(jì) 60 年代和 70 年代初期使用條件致死的 “輔助” 噬菌體來轉(zhuǎn)染分離出的野生型 DNA 的方法。

因此，為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者選擇了兩株重組非洲豬瘟病毒株，ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 和 ASFV-NHVΔTK::GFP，這兩株病毒都表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），并且會(huì)因 p30 基因被 Cas9 切割而受到抑制，將它們作為自輔助病毒，同時(shí)選擇 ΔCD2v::DsRed 作為用于病毒重建的供體基因組。在將 ΔCD2v::DsRed 基因組轉(zhuǎn)染到正常的 WSL 細(xì)胞中，隨后用 ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 或 ASFV-NHVΔTK::GFP 感染后，觀察到的主要是發(fā)綠色熒光的病灶，只有少數(shù)發(fā)紅色熒光或雙熒光的病灶。

作者使用空斑大小和在 WSL 細(xì)胞上的生長動(dòng)力學(xué)測定對重建的 ΔCD2v::DsRed (D) 進(jìn)行了表征。正如預(yù)期的那樣，它表現(xiàn)出與親本 ΔCD2v::DsRed (V) 相似的空斑大小。此外，ΔCD2v::DsRed (D) 的復(fù)制動(dòng)力學(xué)與親本 ΔCD2v::DsRed (V) 幾乎相同。這些結(jié)果驗(yàn)證了作者的假設(shè)，即自輔助病毒可用于從轉(zhuǎn)染的非感染性基因組中重建病毒。

在成功開發(fā)出用于病毒重建的自輔助病毒啟動(dòng)方法后，作者隨后建立了一個(gè)合成基因組學(xué)的基因組組裝過程來組裝非洲豬瘟病毒基因組，這類似于作者先前報(bào)道的用于人類皰疹病毒的方法。作者通過酵母中的轉(zhuǎn)化相關(guān)重組（TAR）技術(shù)，從 12 個(gè)重疊的野生型或修飾片段（或 “部分”）中組裝出了全長的非洲豬瘟病毒 Kenya-IX-1033 “合成” 基因組。

為了完善非洲豬瘟病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，作者試圖使用自輔助病毒（見上文）從組裝好的合成非洲豬瘟病毒基因組中重建活病毒。鑒于之前使用紅色熒光的非洲豬瘟病毒 CD2v 突變體基因組進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證，作者組裝了一個(gè)類似的全長合成基因組，其中整個(gè) CD2v 基因被 mCherry 替換（ΔCD2v::mCh）。

為了克服人工基因組末端帶來的問題，作者又嘗試使用同源的 Kenya-IX-1033 病毒本身作為輔助病毒，從合成組裝的基因組中重建病毒，這將允許通過同源重組修復(fù)有缺陷的人工末端。

在從合成組裝的基因組中成功重建出具有類似野生型生長特性的病毒后，作者隨后試圖證明這種合成基因組學(xué)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)在以組合式、全基因組方式對非洲豬瘟病毒進(jìn)行工程改造方面的實(shí)用性。為此，作者分別和組合地靶向 A238L、K145R 和 I329L 基因進(jìn)行缺失并獲得了這些活病毒。此外，作者還構(gòu)建了含有 mCherry 與 CD2v 的 C 端融合體（CD2v-mCh/p12M）或天藍(lán)色熒光蛋白（Cerulean）與 K145R 的融合體（K145R-Cer/p12M）重組病毒，因它們可用于活細(xì)胞成像，輔助在感染過程中進(jìn)行功能表征。

總之，本研究報(bào)告了一種由創(chuàng)新的自輔助病毒方法介導(dǎo)的非洲豬瘟病毒合成基因組學(xué)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的開發(fā)。非洲豬瘟病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)被用于生成組合式多基因缺失的 IX 型基因型毒株，以及病毒基因產(chǎn)物與熒光蛋白融合的有活性毒株，以促進(jìn)疫苗的開發(fā)，或者更好地理解非洲豬瘟病毒的生物學(xué)特性和致病機(jī)制。